2010CB945300-胸腺与免疫细胞发育的分子调控

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内容摘要

项目名称: 胸腺与免疫细胞发育的分子调控 首席科学家: 赵勇 中国科学院动物研究所 起止年限: 2010 年 1 月-2014 年 8 月 依托部门: 中国科学院 一、研究内容 本项目将紧紧抓住“免疫器官及细胞发育分化”主题,重点围绕上述三个基 本科学问题,应用各种遗传修饰的模式动物(斑马鱼、小鼠、果蝇等)及发育生 物学、进化基因组学、分子细胞生物学等理论和技术手段,分以下4 个课题深入 开展研究:课题1 主要应用斑马鱼、小鼠模型,研究胸腺(胸腺上皮细胞及胸腺 细胞)发育及衰老的关键分子机制,阐明胸腺上皮细胞与胸腺细胞相互作用的调 控规律;课题2 首先应用斑马鱼报告系统获得对造血干细胞发生、维持和向淋巴 系发育的重要分子,然后应用小鼠模型,深入研究其对干细胞向淋巴细胞发育调 控的分子机制;课题3 主要应用果蝇、小鼠及体外免疫细胞诱导体系,研究免疫 细胞向各亚群定向发育分化的调控机制;课题4 主要应用进化/比较基因组学方 法来研究与发现免疫系统发育相关的关键分子,并利用课题1-3 提供的技术平台 与体系,进行验证和深入研究。本项目4个课题各有侧重,进行深入研究,又相 互关联与促进;作为一个研究整体,来阐明胸腺及造血干细胞向成熟免疫细胞发 育的调控规律及发生机制。 二、预期目标 应用多种遗传修饰和基因突变模式动物(斑马鱼、小鼠、果蝇等)及进化基 因组学、免疫学、分子细胞生物学、生化等方面技术手段,重点研究免疫器官胸 腺及免疫细胞发育、分化和衰老过程中的重要调控因子及调控机理。通过本项目 的实验研究,解析免疫系统(特别是胸腺及其相关细胞)发育、分化与功能发挥 的关键分子调控线路,揭示免疫系统发育、分化与功能异常与人类健康的关系。 获得一批免疫系统进化、发育、功能相关重要基因和相关蛋白质,阐明一些关键 分子的功能,为开发拥有自主知识产权的新型免疫制剂、免疫相关疾病诊断与防 治提供重要理论依据。在理论上有自己独到的创新性见解,在技术上建立一系列 研究免疫发育生物学基础理论的现代生物技术平台和先进技术体系。形成一支具 有国际影响和竞争力的研究团队,培养一批从事相关科学研究的中青年学术带头 人与后备力量。 五年预期目标: 本项目将建立多种遗传修饰的斑马鱼和小鼠、移植动物模型、体外免疫细胞 发育分化诱导系统、果蝇天然免疫应答遗传筛选系统、免疫系统进化发育生物学 数据库等技术平台,形成一个先进而完整的免疫发育生物学研究体系。揭示胸腺 发育与衰老、造血干细胞形成及其向免疫前体细胞发育分化、免疫细胞定向发育 分化的几个重要分子调控路线,获得一批重要的免疫发育相关的新基因/蛋白质 及细胞亚型,并对其功能和调节机理进行系统研究,形成重要学术假说。力争在 理论上有突破,在技术上有创新。 具体指标如下: 1. 建立一个先进的免疫发育生物学研究体系与技术平台,包括多种用于研究 免疫系统发育的遗传修饰和基因突变的果蝇、斑马鱼和小鼠,实验方法,技 术手段等。 2. 阐明调控胸腺上皮细胞干细胞向胸腺上皮细胞发育分化及胸腺上皮细胞与 胸腺细胞发育分化中相互作用的2-3 个重要路线。 3. 筛选一批参与胸腺和造血干细胞发育、分化、衰老与功能调控的重要基因, 并对其中5-6 个关键基因进行调控机理研究,为发展新的免疫药物靶分子和 防治免疫相关疾病提供新思路。 4. 解析免疫细胞不同亚群发育分化的1-2 个主要分子通路,为有效调控免疫 应答提供重要依据。 5. 在国际主流学术杂志上发表论文80-90 篇,其中IF>10 的论文12-16 篇; 申请国家/国外发明专利5-10 项。 6. 培养博士后15-20 名,博士、硕士研究生120 名左右。 三、研究方案 1)学术思路: 免疫系统发育与免疫应答是一个极为复杂的生命过程之一。根据目前国际发 展趋势和国内现有研究基础,本项目的总体思路是:应用发育生物学、进化基因 组学、蛋白质组学、系统生物学以及其他最新的理论与技术,凭借各种模式动物 等研究手段与平台,以重要免疫器官胸腺及免疫细胞发育为核心,主要深入探讨 胸腺上皮细胞干细胞向胸腺上皮细胞发育分化的重要调控通路,胸腺上皮细胞与 胸腺细胞发育中相互作用主要机理。同时,围绕胸腺这一免疫器官,我们将进行 淋巴细胞前体细胞及免疫细胞亚群发育调控的实验研究,从而系统理解免疫细胞 发育的整个过程。总之,本项目将在基因进化和功能研究的基础上,通过研究基 因及蛋白质在分子、细胞和整体水平上的相互作用,揭示正常与异常免疫系统发 育过程的调控机理。具体课题设置见下图(图1)。 造血干细胞免疫细胞亚群发育相关的重要基因/蛋白质回答科学问题:胸腺与免疫细胞发育的重要分子调控机制?意义:为免疫相关疾病的防治提供重要理论与技术基础。课题1:胸腺(上皮细胞及胸腺细胞)发育及衰老的分子机制课题2:造血干细胞发生、维持和向淋系发育的分子机制课题3:免疫细胞亚群定向发育分化的调控机制课题4:应用进化/比较基因组学方法研究免疫系统发育关键分子胸腺(上皮细胞、胸腺细胞)胸腺与免疫细胞造血干细胞免疫细胞亚群发育相关的重要基因/蛋白质回答科学问题:胸腺与免疫细胞发育的重要分子调控机制?意义:为免疫相关疾病的防治提供重要理论与技术基础。课题1:胸腺(上皮细胞及胸腺细胞)发育及衰老的分子机制课题2:造血干细胞发生、维持和向淋系发育的分子机制课题3:免疫细胞亚群定向发育分化的调控机制课题4:应用进化/比较基因组学方法研究免疫系统发育关键分子胸腺(上皮细胞、胸腺细胞)胸腺与免疫细胞 图 1. 胸腺与免疫细胞发育的分子调控研究课题设置 主要科研流程见下图(图 2)。 图 2. 主要实验流程框架 2)技术途径: 本项目执行将主要依据已建立和将要建立的模式动物、体外细胞和组织培养 模型,通过下述方法或途径分别在几个层次上阐明免疫器官(胸腺)和免疫细胞 已知免疫系统发育重要基因/蛋白质回答科学问题疾病发生、发展机制建立免疫系统发育研究平台阐明5-6个免疫系统发育相关重要基因调控线路干细胞--------〉胸腺-----〉免疫细胞--〉亚群发育(上皮细胞、胸腺细胞)未知免疫系统发育关键分子遗传修饰和突变果蝇、斑马鱼研究系统比较基因组学手段课题1-3课题4课题1-4确定免疫系统发育重要基因干细胞--------〉胸腺-----〉免疫细胞--〉亚群发育(上皮细胞、胸腺细胞)课题1-4遗传修饰的小鼠等分子生物学手段生物化学手段比较基因组学体外诱导体系基本问题:免疫系统发育的关键因素与调控机制已知免疫系统发育重要基因/蛋白质回答科学问题疾病发生、发展机制建立免疫系统发育研究平台阐明5-6个免疫系统发育相关重要基因调控线路干细胞--------〉胸腺-----〉免疫细胞--〉亚群发育(上皮细胞、胸腺细胞)未知免疫系统发育关键分子遗传修饰和突变果蝇、斑马鱼研究系统比较基因组学手段课题1-3课题4课题1-4确定免疫系统发育重要基因干细胞--------〉胸腺-----〉免疫细胞--〉亚群发育(上皮细胞、胸腺细胞)课题1-4遗传修饰的小鼠等分子生物学手段生物化学手段比较基因组学体外诱导体系基本问题:免疫系统发育的关键因素与调控机制 发生、分化成熟的分子机理。 1.基因水平的研究:应用Northern blot、原位杂交、real-time PCR、CHIP、 RNA 干扰和过表达、基因报告系统等技术,检测基因在所研究细胞和组织中 的转录表达、定位及调控。 2. 蛋白质水平的研究:利用双向电泳、酵母双杂交、免疫共沉淀以及快速定点 突变和结构生物学技术研究蛋白质结构与功能的关系以及蛋白-蛋白相互作 用的分子机制。 3. 细胞与组织水平的研究:利用建立的各种细胞和组织培养体系和流式细胞仪、 激光共聚焦显微镜、显微注射等技术,深入研究基因/蛋白质的功能及调控网 络。 4. 整体水平的研究:涉及的多种模式动物包括果蝇、斑马鱼、小鼠。通过基因 诱变、转基因动物、基因敲除及转基因干细胞移植等技术建立实验模型,观察靶 基因的功能。 5. 免疫分子的进化生物学研究:该研究主要用于筛选人类及相关模式动物的胸 腺及免疫细胞发育分化相关的基因和基因家族,研究其进化起源和功能分化的历 史和动力学过程。 3) 创新点与特色: 立题新颖、前沿:项目十分重视基础理论中的源头创新,对具有应用潜能的研究 将有自主知识产权;以发育生物学的独特视角,研究免疫系统特别是胸腺相关细 胞发育的重要调控分子基础,阐明免疫系统发育分化的重要机制及相关疾病的发 病机理,处于当代生命科学研究前沿,具体研究内容国内外均未见详细的报道。 实验模型及研究手段先进:选用的多种研究动物模型,包括条件性或细胞特异性 基因敲除和基因报告技术如(Aire, FoxN1, MAVS, MyD88, PTEN, TLRs 等)基 因缺失小鼠,scl:GFP、rag1:GFP、FoxN1:GFP 转基因斑马鱼等,着重在体内研 究重要调控基因在胸腺发育、胸腺上皮细胞和淋巴细胞互作中的分子机理。应用 进化基因组学及生物信息学预测及分析相关重要基因及蛋白功能域。实验技术及 分析手段有特色。 学科交叉与优势团队:研究团队由不同研究特色和学科研究人员(发育、免疫、 进化等)组成,学科之间交叉明显。同一位研究骨干可参与2 个或多个课题研究 内容,各研究组之间将进行密切科研合作,共享实验技术平台和实验模型,将团 队优势挖掘出来,此为本项目的组织特色。 4)可行性分析: 本研究团队集结了国内在“分子-细胞-组织-动物模型”各层次以及免疫学、 细胞分子生物学及发育生物学等相关领域中具有较好积累和特色实力的研究人 员。参与本项目的学术骨干在Immunity, Nature Medicine, Proc Natl Acad Sci USA, J Exp Med,Current Biology, Blood, Trends Microbiol, FASEB J, J of Immunology, Hepatology, J of Biological Chemistry, Genome Research, Nucleic Acids Research, Circulation Research, Mechanisms of Development 等国际主流学术杂志上发表 SCI论文200 余篇。参与本项目的科学家一直活跃在本领域的科研前沿及积累了 大量前期工作的基础(请见工作基础部分)。我们相信,通过学科交叉、优势互 补、平台共享、协力攻关,在以下几方面取得重大进展是可行的。 1)通过FoxN1:GFP 转基因斑马鱼报告系统及实验室已建立的其它研究体系,在 发现重要调控胸腺上皮细胞干细胞和其发育的基因及理解其发育机制方面取得 突破的可能性大。 2)利用业已建立的髓质区T 细胞发育研究体系,探索Aire 对胸腺上皮细胞功能 的影响,并揭示Aire 缺陷导致胸腺细胞发育异常的机理和病理生理意义。工作 基础坚实、推论合理、研究方案切实可行,取得突破的可能性大。 3)项目所需关键造血干细胞及淋巴细胞转基因斑马鱼报告系(scl:GFP、 rag1:GFP)已制备并获得一些初步结果。因此,在确定造血干细胞发生及向淋巴 细胞系发育中重要调控基因方面取得重大突破的可能性大。 4)通过酵母双杂交和RNAi 技术,已发现一些参与免疫细胞活化的重要因子,因 此在探讨天然免疫细胞成熟及功能分化方面取得突破性进展的可能性大。 5)运用进化基因组学分子手段发现新基因功能,以结构和功能进化为导向确立 免疫系统发育关键蛋白/多肽的功能表位方面取得重要进展的可能性大,获得免 疫发育相关药物先导的可能性大。 四、年度计划 年 度 研究内容 预期目标 1)建立 FoxN1:GFP 或 Rag1:GFP 绿色荧光转 基因斑马鱼报告系统;应用此系统初步筛选 初步确定 Aire 对胸腺髓质 对胸腺发育起重要作用的部分基因。 上皮细胞分化和功能的影响 2)应用生物工程技术改造小鼠、移植动物模 并确定其分子机制。 型及细胞分子生物学研究手段,研究候选基 初步筛选 FoxN1 在胸腺上皮 因(如 EP2/4)、Smads、FoxN1 通路、AIRE 细胞中作用的下游基因/靶 等在胸腺上皮细胞干细胞及胸腺上皮细胞发 基因谱。 育的作用及初步调控网络。 证实端粒 DNA 相关蛋白 P28 3)通过基因芯片等分子生化技术,初步筛选 在胸腺及免疫细胞衰老过程 FoxN1 在胸腺上皮细胞中作用的下游基因/靶 中的作用 第 一 年 基因谱。 初步研究免疫细胞亚群(特 4)初步确定 Aire 对胸腺髓质上皮细胞分化 别是 Th17、调节性 T 细胞 和功能的影响并确定其分子机制。 等)分化的重要调节分子。 5)证实端粒 DNA 相关蛋白 P28 在胸腺及免疫 确立三种模式动物免疫发育 细胞衰老过程中的作用及其与端粒动力学相 相关的候选基因,并完成相 关性。 关的进化研究。 6)建立胸腺上皮细胞及其干细胞分离、鉴定 完成 ETS 转录因子 Fev, 及定量分析的方法技术。 Ets2, Gabpa, Elf2, 和 7)利用已有的不同基因缺陷小鼠(Smad3, Elk4 在野生型和三种不同 PTEN, IL-2R, MAVS, MyD88,TLRs 等剔除小鼠) 血细胞突变体斑马鱼 及疾病模型(感染、移植、肝炎等),初步研 (cloche, spadetail 和 究 T 细胞亚群(Th17、调节性 T 细胞等)分化 etsrp)胚胎发育不同时期中 的重要调节分子及其机制。 的时空表达图谱。 8) 培 育 出 IL-2R-/-IL-17A-/- 和 在主流杂志上发表论文至少 IL-2R-/-IL-17F-/- 的小鼠。 6 篇。 9)运用人的 cDNA 和 RNAi 文库,通过人的 年 度 研究内容 预期目标 IFN-β启动子基因报告系统筛选参与天然免 疫细胞分化和应答的重要调控因子。 10)参与果蝇天然免疫调控相关新基因的遗 传和生化筛选。 11) 完成 ETS 转录因子 Fev, Ets2, Gabpa, Elf2, 和 Elk4 在野生型和三种不同血细胞突 变体斑马鱼(cloche, spadetail 和 etsrp) 胚胎发育不同时期中的时空表达图谱。 12) 构建新 ETS 转录因子相应的 pCS2+表达 载体;设计并开展相关基因的反义寡聚核苷 酸 Morpholinos 实验。 13) 开展小规模的 ENU 化学诱变,初步筛选一 批影响胸腺和 T 细胞发生的突变体。 14) 进行相关基因进化分析。确立三种模式 动物免疫发育相关的候选基因,并完成相关 的进化研究。建立和完善本课题相关的各种 技术平台。 1)进一步凭借 FoxN1:GFP 或 Rag1:GFP 绿色 获得一批对造血、胸腺、免 荧光转基因斑马鱼报告系筛选对胸腺发育发 疫细胞发育有影响的基因。 第 二 年 育起重要作用的部分基因。 初步构建较系统的造血干细 2)应用生物工程技术改造小鼠、移植动物模 胞基因调控网络模式图。 型及细胞分子生物学研究手段,较深入研究 分析端粒 DNA 相关蛋白 P28 候选基因(如 EP2/4)、AIRE 及 FoxN1 通路等 在胸腺及免疫细胞衰老过程 在胸腺上皮细胞干细胞及胸腺上皮细胞发 中与端粒动力学相关性。 育、衰老的作用及调控网络。 获得相关基因进化表位的基 3)确定 Aire 对胸腺髓质上皮细胞分化和功 础数据,得到初步结论。 能的影响并确定其分子机制。 在主流杂志上发表论文至少 年 度 研究内容 预期目标 4)系统分析端粒 DNA 相关蛋白 P28 在胸腺及 10 篇。 免疫细胞衰老过程中的生物作用及其与端粒 动力学相关性。 5)进一步利用不同基因缺陷小鼠,研究这些 基因在 T 细胞亚群(Th17、调节性 T 细胞等) 分化的可能作用及其调控机制。 6)对候选基因进行初步的功能分析。 7)利用 MAVS、MyD88 单基因和双基因剔除小 鼠,初步探讨 RLRs 和 TLRs 途径在免疫细胞 发育中的作用以及它们的协同作用机制。 8) 开展功能缺失和过量表达实验,确定 ETS 转录因子在造血干细胞发育分化及迁移中的 作用;并阐明其与其它相关主控基因的上位 关系。 9) 完成中小规模的 ENU 化学诱变,确定一批 影响胸腺和 T 细胞发育的重要斑马鱼突变 体。 10) 预测重要相关蛋白的进化表位;基因克 隆,表达载体构建和重组蛋白的生产方案的 优化。 11)获得进化表位的基础数据。克隆相关的 基因并选择不同的表达载体优化表达和纯化 方法。 第 1)建立 1-2 个生物工程技术改造小鼠,确定 确定 1-2 个对胸腺髓质上皮 1-2 个对胸腺上皮细胞及胸腺细胞分化和功 细胞发育和功能具有重要影 三 能具有重要影响的新功能基因。 响的新功能基因。 2)较深入研究几个候选基因在胸腺上皮细胞 确定造血干细胞在斑马鱼胚 年 度 研究内容 预期目标 年 干细胞及胸腺上皮细胞发育的作用及调控分 胎时期的起源、发育分化和 子网络。 迁移路线。 3)完成利用不同基因基因缺陷小鼠,研究这 完成构建较系统的造血干细 些基因在 T 细胞亚群(Th17、调节性 T 细胞 胞基因调控网络模式图。 等)分化的可能作用及其调控机制。 明确 1-3 个对免疫细胞亚群 4 ) 检 测 IL-2R-/-IL-17A-/- 和 发育有 重要作 用的调 节通 IL-2R-/-IL-17F-/-双基因敲除小鼠的细胞 路。 亚群,炎性因子的变化及组织病理变化。 明确 1-3 个对免疫细胞亚群 5)深入探讨 RLRs 和 TLRs 两条途径在免疫 发育有重要作用的分子表位 细胞发育中的作用以及它们的协同作用机制 特征及进化特点。 6)主要利用敲除、干扰或过量表达等方法初 在主流杂志上发表论文至少 步分析目的 microRNAs 在免疫细胞发育过程 15 篇。 中的调控作用。 7)确定造血干细胞在斑马鱼胚胎时期的起 源、发育分化和迁移路线。 8)完成构建较系统的造血干细胞基因调控网 络模式图,并阐明 ETS 转录因子在血液发生、 保持和淋系分化中的分子机制。 9)开展定位克隆影响造血干细胞、T 淋巴细 胞及胸腺发育的重要突变体/基因。 10)运用反向 PCR 方法完成丙氨酸突变体重 组表达载体的构建,确定相关蛋白的重要功 能位点。 年 度 研究内容 预期目标 1)建立目的基因缺失小鼠,证实 1-2 个对胸 证实 1-2 个对胸腺发育具有 腺发育具有重要影响的新功能基因。 重要影响的新功能基因。 2)较深入研究候选基因在胸腺上皮细胞干细 确定目的 microRNAs 在免 胞及胸腺上皮细胞发育、衰老的作用及调控 疫细胞发育过程中的调控作 分子网络。 用。 3)初步阐明筛选到的影响斑马鱼造血干细 明确 1-3 个对免疫细胞亚群 第 胞、T 淋巴细胞及胸腺发育的重要突变体/基 发育有 重要作 用的调 节通 因的分子机制。 路。 四 4)进一步分析目的 microRNAs 在免疫细胞发 理解 1-2 个目的基因结构与 育过程中的调控作用。 功能之间的关系。 年 5)采用 Microarray 的方法,比较野生型、 在主流杂志上发表论文至少 MAVS、MyD88 单基因和双基因剔除小鼠的巨噬 15 篇。 细胞的转录表达谱,发现与巨噬细胞表型和功 能重要相关的基因。解析蛋白的功能表面。 6)研究目的基因结构与功能之间的关系;利 用建立的实验平台解析相关蛋白质的重要功 能表面特征与位点。 1)应用已建立目的基因缺失小鼠及体外细胞 解析 1-2 个对胸腺发育具有 分析系统,深入研究 1-2 个对胸腺发育具有 重要影响的功能基因的调控 重要影响的功能基因的调控分子网络。 2)进行 IL-2R-/-IL-17A-/-IL-17F-/-三基因敲 除鼠的各种细胞亚群特征变化并研究其发生 机制。 分子网络。 确定新筛选的影响斑马鱼造 血干细胞和 T 淋巴细胞发育 的重要突变体/基因的分子 3)完成重要调控免疫细胞发育候选基因的分 机制。 子调控机制的研究。 4)完成目的 microRNAs 在免疫细胞发育过程 中调控作用机制的研究。 完成 2-3 个与斑马鱼免疫系 统发育相关的哺乳类同源基 因的功能和分子机制。 第 五 年 年 度 研究内容 预期目标 5)应用动物疾病模型,对目的基因进行深入 研究。 理解 2-3 个对胸腺及免疫细 胞发育具有重要影响的功能 6)基于已经确定的蛋白质功能表面设计具有 分子结构与功能之间的关 独特功能的新型分子,为药物先导设计提供 系。 基础,确定设计分子的生物特性。 在主流杂志上发表论文至少 15 篇。

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